Современные методы диагностики вич-инфекции. Современные методы диагностики вич-инфекции Характеристика и принцип работы набора

Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции становится крайне важной мерой, т. к. ранее начало лечения может во многом предопределить дальнейшее развитие заболевания и продлить жизнь больного . В последние годы наблюдается весомый прогресс в области выявления этой страшной болезни: на смену старым тест-системам приходят более совершенные, методы обследования становятся более доступными, и их точность значительно повышается.

В данной статье расскажем о современных методах диагностики ВИЧ-инфекции, знать которые полезно для своевременного лечения данной проблемы и поддержания нормального качества жизни заболевшего.

Методики диагностики ВИЧ

В России для диагностики ВИЧ-инфекции проводится стандартная процедура, включающая в себя два уровня:

• ИФА тест- система (скрининговый анализ);
• иммунный блоттинг (ИБ).

Также для диагностики могут применяться другие методики:

• экспресс-тесты.

ИФА тест-системы

На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа.

Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель.

Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФА-тест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%).

Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером).

Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней:

• отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту;
• ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови;
• ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови;
• положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа.

Почему ИФА-тест может давать ложноположительные результаты?

Ложноположительные результаты ИФА-теста на ВИЧ могут наблюдаться при неправильной обработке крови или у больных с такими состояниями и заболеваниями:

• множественная миелома;
• инфекционные заболевания, спровоцированные вирусом Эпштейна-Барр;
• состояние после ;
• аутоиммунные заболевания;
• на фоне беременности;
• состояние после вакцинации.

При вышеописанных причинах в крови могут присутствовать неспецифические перекрестно реагирующие антитела, выработка которых была спровоцирована не ВИЧ-инфекцией.

В последние годы частота ложноположительных результатов существенно снизилась благодаря применению тест-систем III и IV поколения, которые содержат более чувствительные пептидные и рекомбинантные белки (они синтезируются при помощи генной инженерии in vitro). После начала применения таких ИФА-тестов частота ложноположительных результатов значительно снизилась и составляет около 0,02-0,5%.

Выявление ложноположительного результата не означает, что человек инфицирован ВИЧ. В таких случаях ВОЗ рекомендует провести еще один ИФА-тест (обязательно IV поколения).

Кровь пациента отправляется в референс или арбитражную лабораторию с пометкой «повторить» и исследуется на ИФА тест-системе IV поколения. Если результат нового анализа отрицательный, то первый результат признается ошибочным (ложноположительным) и ИБ не проводится. При положительном или сомнительном результате во время второго теста больному обязательно назначается проведение ИБ через 4-6 недель для подтверждения или опровержения ВИЧ-инфицирования.

Иммунный блоттинг

Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки.

Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция проводится на специальной аппаратуре под воздействием электрического поля). На гель из сыворотки крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий.

ИБ считается положительным если:

• по критериям American CDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
• по критериям American FDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160.

В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование.

При отсутствии линий – ИБ является отрицательным.

При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при:

• онкологических заболеваниях;
• беременности;
• частых трансфузиях крови.

В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ).

Полимеразная цепная реакция

Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям.

Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения.

ПЦР применяется в таких случаях:

• для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей;
• для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ;
• для контроля концентрации ВИЧ в крови;
• для исследования донорской крови.

Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций.

Экспресс-методы

Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестах, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска.

Как и после тестов ИФА, результаты экспресс-тестов должны подтверждаться анализом ИБ. Только после этого может ставиться диагноз о ВИЧ-инфицировании.

Существуют экспресс-наборы для домашнего тестирования. Тест OraSure Technologies1 (США) одобрен FDA, продается без рецепта и может применяться для выявления ВИЧ. После проведения теста, в случае положительного результата, больному рекомендуется пройти обследование в специализированном центре для подтверждения диагноза.

Остальные тесты для домашнего использования еще не были одобрены FDA и их результат может быть очень сомнительным.

Несмотря на то, что экспресс-тесты по своей точности уступают ИФА-тестам IV поколения, они широко применяются для дополнительного тестирования населения.

Сдать анализы на выявление ВИЧ-инфекции можно в любой поликлинике, ЦРБ или в специализированных СПИД-центрах. На территории России они проводятся абсолютно конфиденциально, или анонимно. Каждый пациент может рассчитывать на получение медицинской или психологической консультации до или после проведения анализа. Платить за тесты на ВИЧ придется только в коммерческих лечебных учреждениях, а в государственных поликлиниках и больницах они выполняются бесплатно.

О том, какими путями можно заразиться ВИЧ-инфекцией и какие мифы существуют о возможностях заразиться, читайте в

Уникальный номер реестровой записи

Регистрационный номер медицинского изделия

ФСР 2011/10182

Дата государственной регистрации медицинского изделия

Наименование медицинского изделия

Набор реагентов "МилаЛаб-ИФА-ВИЧ-АГАТ" тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), ВИЧ-1 группы О и антигена р24 ВИЧ-1 по ТУ 9398-187-05941003-2017
в составе: - Иммуносорбент - планшет полистироловый 96-луночный разборный до стрипов (или до лунок), в лунках которого сорбированы искусственные антигены - gp160, gp41, p31 ВИЧ-1, gp41 ВИЧ-1 группы О, gp36 ВИЧ-2 и антитела к антигену p24 ВИЧ-1: комплект 1 (1 планшет), комплект 2 (2 планшета), комплект 3 (5 планшетов), - Конъюгат-1: комплект 1 (1 фл. 1,2 мл), комплект 2 (1 фл. 1,2 мл), комплект 3 (1 фл. 3,6 мл или 3 фл. по 1,2 мл), - Конъюгат-2: комплект 1 (1 фл. 2,0 мл), комплект 2 (1 фл. 2,0 мл), комплект 3 (1 фл. 4,0 мл или 2 фл. по 2,0 мл), - РРК-1 - раствор для разведения Конъюгата-1: комплект 1 (1 фл. 12,0 мл), комплект 2 (1 фл. 12,0 мл), комплект 3 (3 фл. по 12,0 мл), - РРК-2 - раствор для разведения Конъюгата-2: комплект 1 (1 фл. 20,0 мл), комплект 2 (1 фл. 20,0 мл), комплект 3 (2 фл. по 20,0 мл), - К+АТ - контрольный положительный образец, содержащий антитела к ВИЧ: комплект 1 (1 фл. 2,0 мл), комплект 2 (1 фл. 2,0 мл), комплект 3 (1 фл. 4,0 мл или 2 фл. по 2,0 мл), - К+АГ - контрольный положительный образец, содержащий искусственный антиген р24 ВИЧ-1: комплект 1 (1 фл. 2,0 мл), комплект 2 (1 фл. 2,0 мл), комплект 3 (1 фл. 4,0 мл или 2 фл. по 2,0 мл), - К- - контрольный отрицательный образец: комплект 1 (1 фл. 2,5 мл), комплект 2 (1 фл. 2,5 мл), комплект 3 (1 фл. 5,0 мл или 2 фл. по 2,5 мл), - ПР - промывочный раствор: комплект 1 (1 фл. 50,0 мл), комплект 2 (1 фл. 120,0 мл), комплект 3 (2 фл. по 120,0 мл), - Стоп-реагент: комплект 1 (1 фл. 25,0 мл), комплект 2 (2 фл. по 25,0 мл), комплект 3 (2 фл. по 50,0 мл или 4 фл по 25,0 мл), - СБ - субстратный буферный раствор: комплект 1 (1 фл. 25,0 мл), комплект 2 (1 фл. 25,0 мл), комплект 3 (2 фл. по 50,0 мл или 3 фл. по 25,0 мл), - ТМБ - раствор, содержащий 3,3",5,5"-тетраметилбензидин: комплект 1 (1 фл. 2,5 мл), комплект 2 (1 фл. 2,5 мл), комплект 3 (2 фл. по 3,5 мл или 3 фл. по 2,5 мл). Принадлежности: - крышки к полистироловым 96-луночным планшетам: комплект 1 (1 шт.), комплект 2 (2 шт.), комплект 3 (5 шт.) или - плёнки защитные для ИФА-планшетов: комплект 1 (2 шт.), комплект 2 (4 шт.), комплект 3 (10 шт.), - наконечники одноразовые: комплект 1 (16 шт.), комплект 2 (32 шт.), комплект 3 (80 шт.), - ванночки пластиковые для жидких реагентов: комплект 1 (2 шт.), комплект 2 (4 шт.), комплект 3 (10 шт.), - пакеты полиэтиленовые с замком Zip-Lock: комплект 1 (1 шт.), комплект 2 (2 шт.), комплект 3 (3 шт.).

Наименование организации - заявителя медицинского изделия

Место нахождения организации-заявителя медицинского изделия

Юридический адрес организации-заявителя медицинского изделия

603014, Россия, г. Нижний Новгород, ул. Коминтерна, д. 47

Наименование организации-производителя медицинского изделия или организации-изготовителя медицинского изделия

ООО "НПО "Диагностические системы"

Место нахождения организации-производителя медицинского изделия или организации - изготовителя медицинского изделия

603093, Россия, г. Нижний Новгород, ул. Яблонева, д. 22, а/я 69

Юридический адрес организации-производителя медицинского изделия или организации - изготовителя медицинского изделия

1 Назначение набора

1.1 Набор предназначен для одновременного выявления антител к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) и антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотке и плазме крови человека “in vitro” методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.

2 Характеристика и принцип работы набора

2.1 Состав набора:

2.2 Основные компоненты набора " ИФА-HIV 1,2 AGAT " – иммуносорбент, раствор конъюгата №1 и конъюгат №2.

Иммуносорбент представляет собой полистироловый планшет, в лунках которого сорбирована смесь рекомбинантных антигенов ВИЧ-1 (gp41) и ВИЧ-2 (gp36) и моноклональных антител к антигену р24 ВИЧ-1.

Раствор конъюгата №1 представляет собой смесь меченых биотином моноклональных человеческих антител против антигена р24 ВИЧ-1 и меченых биотином рекомбинантных белков ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Конъюгат №2 представляет собой стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена.

Положительный контрольный образец АТ – сыворотка крови человека, содержащая антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, не содержащая антитела к вирусу гепатита С и Treponema pallidum, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Положительный контрольный образец АГ – сыворотка крови человека содержащая нативный антиген р24 ВИЧ-1, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС, антиген р24 ВИЧ-1 и НВs-антиген, инактивированная прогреванием в течение 3 ч при температуре 56 ºC.

Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета раствора конъюгата №1 и образцов сывороток инфицированной крови антиген р24 связывается как со специфическими антителами на твердой фазе, так и с моноклональными биотинилированными анти-р24 антителами, входящими в состав раствора конъюгата №1; ВИЧ-специфические антитела связываются как с рекомбинантными антигенами ВИЧ-1 и ВИЧ-2, сорбированными на твердой фазе, так и с антигенами, входящими в состав раствора конъюгата №1, образуя комплексы антиген-антитело. Иммунные комплексы анти-р24 специфических антител и антигена р24 выявляются конъюгатом №2. После отмывания несвязавшихся компонентов в лунки планшета добавляют раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена ТМБ.

Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты), и интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм.

Величина ОП прямо пропорциональна концентрации специфических антител и/или антигена р24 в образце сыворотки или плазмы. Чем выше содержание антител и/или антигена р24 в образце сыворотки, тем выше интенсивность окрашивания.

2.3 Набор рассчитан на проведение на проведение 24 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений , включая контрольные образцы.

3 Меры предосторожности при работе с набором

3.1 Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:

Работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;

Работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями , , и .

3.2 Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.

3.3 При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.

3.4 Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями .

3.5 Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями .

4 Правила работы с набором

4.1 Для исключения ложных результатов исследуемые образцы необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение (5-10) мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сывороток можно хранить при температуре (2-8) °С не более 5 сут. Замороженные образцы (желательно до температуры не менее минус 20 °С) можно хранить не более 1 года. Необходимо избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов.

Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.

Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:

Не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;

Для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;

Всю используемую для приготовления реагентов посуду не обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;

Для работы с хромогеном ТМБ и РХ необходимо использовать отдельные емкости для растворов, наконечники для пипеток, посуду.

Необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;

Время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;

При использовании промывателя следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;

Необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);

Дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;

Для работы с исследуемыми и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником.

При внесении в лунки РК-1 нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета и раствора, находящегося в лунках.

Во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.

4.2 При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

5 Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

5.1 Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 450 нм;

Полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);

Суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;

Пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,01 до 5,0 мл;

Пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;

Мерный цилиндр вместимостью 2000 мл;

Колба лабораторная вместимостью 2000 мл;

Флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;

Ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);

Вата медицинская гигроскопическая;

Бумага фильтровальная;

Перчатки резиновые хирургические;

Раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;

Раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;

Вода деионизированная или дистиллированная;

Контейнер для сбора твердых отходов;

Контейнер для слива жидких отходов.

6 Подготовка к проведению анализа

6.1 Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин .

Все образцы сывороток (плазмы) и реагенты перед проведением анализа тщательно перемешать.

Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.

6.2 Приготовление раствора для промывания планшета

Внимание! Раствор для промывания планшета готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Если флакон с ФСБ-Т×25 содержит осадок, его необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) °С до полного растворения осадка. В мерный цилиндр вместимостью 2000 мл внести содержимое флакона с ФСБ-Т×25, затем добавить дистиллированной воды до метки 1250 мл и аккуратно перемешать раствор. Раствор можно хранить при температуре (2-8) °С в течение 72 ч.

В случае использования одного или несколько стрипов содержимое флакона с ФСБ-Т×25 интенсивно встряхнуть в течение (20-30) с, отобрать необходимый объем раствора (таблица А.1) в мерный стакан или цилиндр, добавить необходимое количество дистиллированной воды и перемешать раствор. Неиспользованный ФСБ-Т×25 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.3 Подготовка иммуносорбента

Иммуносорбент готов к использованию.

Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С в течение 3 месяцев.

6.4 Подготовка К + АТ, К – , РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагента

К + АТ, К – , РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент готовы к использованию.

Внимание! Во флаконе с РК-1 возможно выпадение осадка. Для проведения анализа необходимо использовать надосадочную жидкость.

Неиспользованные РК-1, РР-К2, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

Остаток К + АТ и К - после вскрытия флакона можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.5 Приготовление раствора К + АГ

Внимание! Раствор К + АГ готовить за 15 мин до начала проведения анализа!

Для восстановления лиофилизированного К + АГ перед вскрытием флакона легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флакона или пробки. Открыть флакон и положить пробку перевернутой на сухую поверхность. Внести во флакон 0,8 мл дистиллированной воды. Флакон закрыть пробкой, выдержать в течение 10 мин при температуре (18-25) °С и аккуратно наклоняя и вращая флакон, перемешать его содержимое до полного растворения, избегая образования пены.

Восстановленный К + АГ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение одного месяца, при температуре минус 20 °С – в течение шести месяцев. Допускается однократное замораживание-оттаивание восстановленного К + АГ.

6.6 Приготовление раствора Кг-2 в рабочем разведении

Из флакона с Кг-2 отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с РР-К2. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К2, добавить Кг-2 в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Раствор Кг-2 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием! Раствор Кг-2 в рабочем разведении можно хранить в течение 15 мин при температуре (18-25) °С. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток Кг-2 можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

6.7 Приготовление рабочего раствора субстрата

Флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием при температуре (37±1) ° С до полного растворения кристаллов .

Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.

В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромогена ТМБ в соответствии с таблицей А.1 и перемешать раствор, не допуская образования пены.

Внимание! Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить в течение 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.

Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!

Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.

7 Требования к промыванию планшета

На всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;

Необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок;

Необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;

При каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;

Некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.

8 Проведение анализа

8.1 В любые две лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) К + АТ , в две другие лунки– по 0,07 мл (70 мкл) К + АГ , в три другие лунки – по 0,07 мл (70 мкл) К – .

Внимание! При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать для К – - две лунки, для К + АТ – одну лунку, для К + АГ – одну лунку.

В остальные лунки планшета внести по 0,07 мл (70 мкл) исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови человека.

Внимание! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!

8.2 Во все лунки планшета поверх контрольных образцов и исследуемых образцов сыворотки (плазмы) крови сразу внести по 0,05 мл (50 мкл) РК-1 . Содержимое лунок перемешать осторожным постукиванием по краям планшета.

8.3 (37 ± 1) ° С в течение 60 мин .

Внимание! За (1-2) мин до окончания инкубации приготовить раствор Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.4 Удалить содержимое лунок с помощью промывателя, затем промыть лунки планшета раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.5 Внести во все лунки планшета по 0,15 мл (150 мкл) раствора Кг-2 в рабочем разведении (п 6.6).

8.6 Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37 ± 1) ° С в течение 10 мин .

8.7 Удалить содержимое лунок планшета с помощью промывателя, затем промыть лунки планшетов раствором для промывания планшета (п 6.2) семь раз.

8.8 Во все лунки планшета внести по 0,15 мл (150 мкл) рабочего раствора субстрата (п 6.7).

При приготовлении рабочего раствора субстрата (п.6.7) флакон с хромогеном ТМБ необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37 ± 1)° С до полного растворения кристаллов.

8.9 Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37 ± 1) ° С в защищенном от света месте в течение 15 мин .

Внимание! По окончании инкубации в лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора от бесцветной до голубой различной интенсивности в зависимости от концентрации антител и/или антигена в исследуемом образце сыворотки.

8.10 Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента .

Внимание! В лунках с образцами сывороток, содержащими антитела к ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2, и/или антиген р24 ВИЧ-1, произойдет изменение окраски раствора с голубой на желтую различной интенсивности.

8.11 Не позже чем через (1-2) мин после остановки реакции определить ОП в лунках в одноволновом режиме при длине волны 450 нм .

9 Обработка результатов анализа

9.2 Результаты учитывать только в том случае если:

Значение ОПср К - не превышает 0,2 ОЕ;

Каждое отдельное значение ОП К - не должно отклоняться от ОПср К - более чем на 30%. Если одно из трех значений ОП К - выходит за этот предел, его следует исключить из расчета ОПср К - . Если два из трех значений ОП К - выходят за этот предел, анализ следует повторить на реагентах нового набора;

Значение ОПср К + АТ более 1,0 ОЕ;

Значение ОПср К + АГ более 1,0 ОЕ.

9.3 При соблюдении выше перечисленных условий вычислить критическое значение (ОПкрит.), ОЕ, по формуле (1):

ОПкрит. = ОПср К - + 0,14 (1).

10 Аналитические и диагностические характеристики

Чувствительность набора реагентов ИФА-HIV 1,2 AGAT по выявлению антигена р24 ВИЧ-1 –

Специфичность набора реагентов ИФА-HIV 1,2 AGAT – 100 % Стандарт АТ(-)ВИЧ. Стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого и второго типов (ВИЧ-1,2) и антиген ВИЧ-1(р24).ОСО42-28-214-02П.Кат№INS-20. ЗАО «МБС».

11 Форма выпуска набора

11.1 Набор выпускается в пяти вариантах комплектации:

1 комплект 1Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА на разборном планшете: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы;

2 комплект 2М – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

3 комплект 2Р – проведение анализа ручным способом. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборны х планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений , включая контрольные образцы;

4 комплект А2М – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 2 постановок ИФА на монолитных планшетах: 1 постановка – 1 планшет. Всего – 192 определений, включая контрольные образцы;

5 комплект А2Р – проведение анализа на автоматическом анализаторе. Набор рассчитан на проведение 24 постановок ИФА на 2 разборных планшетах: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 192 определений, включая контрольные образцы.

12 Условия хранения и применения набора

12.1 Хранение набора должно производиться в чистом, защищенном от влаги и света помещении при температуре (2-8)° С в течение всего срока годности. Запрещается замораживать компоненты набора.

12.2 Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

12.3 Срок годности набора – 12 месяцев .

Приложение А

Таблица А.1 – Расход реагентов набора для постановки ИФА

Библиография