В анализе липиды равны 6. Клинико-диагностическое значение определения уровня общих липидов в плазме (сыворотке) крови
Для количественного определения общих липидов в сыворотке крови чаще всего пользуются колориметрическим методом с фосфованилиновым реактивом. Общие липиды взаимодействуют после гидролиза серной кислотой с фосфованилиновым реактивом с образованием красного окрашивания. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.
1. В три пробирки внесите реактивы по следующей схеме:
2. Содержимое пробирок перемешайте, оставьте в темноте на 40-60 мин. (цвет раствора меняется с желтого на розовый).
3. Снова перемешайте и измерьте оптическую плотность при 500-560 нм (зеленый светофильтр) против слепой пробы в кювете толщиной слоя 5 мм.
4. Рассчитайте количество общих липидов по формуле:
где D 1 – экстинкция опытной пробы в кювете;
D 2 – экстинкция калибровочного раствора липидов в кювете;
Х - концентрация общих липидов в стандартном растворе.
Дайте определение понятия «общие липиды». Сравните полученное Вами значение с нормальными величинами. О каких биохимических процессах можно судить по данному показателю?
Опыт 4. Определение содержания b- и пре-b-липопротеинов в сыворотке крови.
2. Набор пипеток.
3. Стеклянная палочка.
5. Кюветы, 0,5 см.
Реактивы. 1. Сыворотка крови.
2. Хлорид кальция, 0,025М раствор.
3. Гепарин, 1%-ный раствор.
4. Дистиллированная вода.
1. В пробирку налейте 2 мл 0,025 М хлористого кальция и добавьте 0,2 мл сыворотки крови.
2. Перемешайте и измерьте оптическую плотность пробы (D 1) на ФЭК-е при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против дистиллированной воды. Запишите значение оптической плотности D 1 .
3. Затем в кювету добавьте 0,04 мл 1%-го раствора гепарина (1000ЕД в 1 мл) и точно через 4 мин вновь измерьте оптическую плотность D 2 .
Разница значений (D 2 – D 1) соответствует оптической плотности, обусловленной осадком b-липопротеинов.
Рассчитайте содержание b- и пре-b-липопротеинов по формуле:
где 12 - коэффициент, для переводы в г/л.
Укажите место биосинтеза b-липопротеинов. Какую функцию они выполняют в организме человека и животных? Сравните полученное Вами значение с нормальными величинами. В каких случаях наблюдаются отклонения от нормальных величин?
Занятие № 16. «Обмен липидов (часть 2)»
Цель занятия : изучить процессы катаболизма и анаболизма жирных кислот.
ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:
1. Биохимический механизм окисления жирных кислот.
2. Обмен кетоновых тел: образование, биохимическое назначение. Какие факторы предрасполагают к появлению кетозов у животных?
3. Биохимический механизм синтеза жирных кислот.
4. Биосинтез триацилглицеролов. Биохимическая роль этого процесса.
5. Биосинтез фосфолипидов. Биохимическая роль этого процесса.
Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________
Экспериментальная работа.
Опыт 1. Экспресс метод определения кетоновых тел в моче, молоке, сыворотке крови (проба Лестраде).
Приборы. 1. Штатив с пробирками.
2. Набор пипеток.
3. Стеклянная палочка.
4. Фильтровальная бумага.
Реактивы. 1. Порошок реактивов.
3. Сыворотка крови.
4. Молоко.
1. На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля поместите небольшое количество (0,1-0,2 г) порошка реактивов.
2. Несколько капель сыворотки крови перенесите на порошок реактивов.
Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно - содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту - в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел.
Следует помнить, что тест более чем в 3 раза чувствительнее при определении ацетоуксусной кислоты, чем ацетона. Из всех кетоновых тел в сыворотке крови человека ацетоуксусная кислота является преобладающей, однако в крови здоровых коров 70-90% кетоновых тел составляет b-оксимасляная кислота, в молоке на ее долю приходится 87-92%.
Сделайте вывод по результатам Вашего исследования. Объясните, чем опасно избыточное образование кетоновых тел в организме человека и животных?
Гиперлипидемия (гиперлипемия) - увеличение концентрации общих липидов плазмы как физиологическое явление может наблюдаться через 1-4 ч после приема пищи. Алиментарная гиперлипемия выражена тем сильнее, чем ниже уровень липидов в крови больного натощак.
Концентрация липидов в крови изменяется при целом ряде патологических состояний:
Нефротический синдром, липоидный нефроз, острый и хронический нефрит;
Билиарный цирроз печени, острый гепатит;
Ожирение- атеросклероз;
Гипотиреоз;
Панкреатит и т.д.
Исследование уровня холестерола (ХС) отражает лишь патологию обмена липидов в организме. Гиперхолестеролемия – документированный фактор риска коронарного атеросклероза. ХС – обязательный компонент мембраны всех клеток, особые физико-химические свойства кристаллов ХС и конформация его молекул способствует упорядоченности и подвижности фосфолипидов в мембранах при изменении температуры, что позволяет мембране находится в промежуточном фазовом состоянии («гель – жидкий кристалл») и сохранять физиологические функции. ХС используется в качестве предшественника при биосинтезе стероидных гормонов (глюко- и минералокортикоидов, половых), витамина D 3 , а также желчных кислот. Условно можно выделить 3 пула ХС:
А - быстро обменивающийся (30 г);
Б – медленно обменивающийся (50 г);
В – очень медленно обменивающийся (60 г).
Эндогенный холестерин в значительном количестве синтезируется в печени (80%). Экзогенный холестерин поступает в организм в составе продуктов животного происхождения. Транспорт ХС из печени к внепеченочным тканям осуществляют
ЛПНП. Выведение ХС из печени из внепеченочных тканей в печень производят зрелые формы ЛПВП (50% - ЛПНП, 25% ЛПВП, 17%ЛПОНП, 5% -ХМ).
Гиперлипопротеинемия и гиперхолестеринемия (классификация Фредриксона):
1 тип – гиперхиломикронемия;
2 тип - а – гипер-β-липопротеинемия, б - гипер -β и гиперпре-β-липопротеинемия;
3 тип – дис-β-липопротеинемия;
4 тип – гипер-пре-β-липопротеинемия;
5 тип – гиер-пре-β-липопротеинемия и гиперхиломикронемия.
Наиболее атерогенными являются 2 и 3 типы.
Фосфолипиды - группа липидов, содержащих помимо фосфорной кислоты (обязательный компонент) спирт (обычно глицерин), остатки жирных кислот и азотистые основание. В клинико-лабораторной практике имеет место метод определения уровня общих фосфолипидов, уровень которых повышается у больных с первичными и вторичными гиперлипопротеинемиями IIа и IIб. Понижение имеет место при ряде заболеваний:
Алиментарная дистрофия;
Жировая дегенерация печени,
Портальный цирроз;
Прогрессирование атеросклероза;
Гипертириоз и т. д.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является свободно-радикальным процессом, инициация которого происходит при образовании активных форм кислорода – супероксидиона О 2 . ; гидроксильного радикала НО . ; гидропероксидного радикала НО 2 . ; синглетного кислорода О 2 ; гипохлоритного иона ClO - . Основными субстратами ПОЛ являются полиненасыщенные жирные кислоты, находящиеся в структуре фосфолипидов мембран. Сильнейшим катализатором являются ионы металлов железа. ПОЛ – это физиологический процесс, который имеет важное значение для организма, так как регулирует проницаемость мембран, влияет на деление и рост клеток, начинает фагосинтез, является путем биосинтеза некоторых биологических веществ (простагландинов, тромбоксанов). Контроль за уровнем ПОЛ осуществляет антиоксидантная система (аскорбиновая кислота, мочевая кислота, β- каротин и т.д.). Потеря равновесия между двумя системами приводит к гибели клеток и клеточных структур.
Для диагностики принято определять в плазме и эритроцитах крови содержание продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, шиффовы основания), концентрацию основного природного антиоксиданта – альфа-токоферола с расчетом показателя коэфицента МДА/ТФ. Интегральным тестом оценки ПОЛ является определение проницаемости эритроцитарных мембран.
2. Пигментный обмен совокупность сложных превращений различных окрашенных веществ в организме человека и животных.
Наиболее хорошо известен пигмент крови – гемоглобин (хромопротеин, который состоит из белковой части глобина и простетической группы, представленной 4 гемами, каждый гемм состоит из 4 пиррольных ядер, которые связаны между собой метиновыми мостиками, в центре находится ион железа со степенью окисления 2 +). Средний срок жизни эритроцита составляет 100-110 суток. По окончании этого периода происходит разрушение и деструкция гемоглобина. Процесс распада начинается уже в сосудистом русле, завершается в клеточных элементах системы фагоцитирующихмононуклеаров (купферовские клетки печени, гистиоциты соединительной ткани, плазматические клетки костного мозга). Гемоглобин в сосудистом русле связывается с гаптоглобином плазмы и задерживается в сосудистом русле, не проходя почечный фильтр. Вследствие трипсиноподобного действия бета-цепи гаптоглобина и вызванных его влиянием конформационных изменений в порфириновом кольце гема создаются условия для более легкого разрушения гемоглобина в клеточных элементах системы фагоцитирующихмононуклеарон.Образующийся таким образом высокомолекулярный пигмент зеленого цвета вердоглобин (синонимы: вердогемоглобин, холеглобин, псевдогемоглобин) представляет собой комплекс, состоящий из глобина, разорванной системы порфиринового кольца и трехвалентного железа. Дальнейшие превращения приводят к потере вердоглобином железа и глобина, в результате чего порфириновое кольцо разворачивается в цепь и формируется низкомолекулярный желчный пигмент зеленого цвета-биливердин . Почти весь он ферментативным путем восстанавливается в важнейший красно-желтый пигмент желчи - билирубин, являющийся обычным компонентом плазмы крови.На поверхности плазматической мембраны гепатоцита подвергается диссоциации. При этом высвобожденный билирубин образует временный ассоциат с липидами плазматической мембраны и перемещается через нее благодаря деятельности определенных ферментных систем. Дальнейшее прохождение свободного билирубина в клетку происходит при участии в этом процессе двух белков-переносчиков: лигандина (он транспортирует основное количество билирубина) и протеина Z.
Лигандин и протеин Z обнаружены также в почках и кишечнике, поэтому при недостаточности функции печени они свободны компенсировать ослабление процессов детоксикации в этом органе. И те и другие достаточно хорошо растворимы в воде, но лишены способности перемещаться через липидный слой мембраны. За счет связывания билирубина с глюкуроновой кислотой присущая свободному билирубину токсичность в значительной мере теряется. Гидрофобный, липофильный свободный билирубин, легко растворяясь в липидах мембраны и проникая вследствие этого в митохондрии, разобщает в них дыхание и окислительное фосфорилирование, нарушает синтез белка, поток ионов калия через мембрану клеток и органелл. Это отрицательно сказывается на состоянии центральной нервной системы, вызывая у больных ряд характерных неврологических симптомов.
Билирубинглюкурониды (или связанный, конъюгированный билирубин) в отличие от свободного билирубина тотчас вступают в реакцию с диазореактивом (“прямой” билирубин). Следует иметь в виду, что в самой плазме крови билирубин, не конъюгированный с глюкуроновой кислотой, может быть либо связан с альбумином, либо нет. Последняя фракция (не связанного ни с альбумином, ни с липидами, ни с другими компонентами крови билирубина) наиболее токсична.
Билирубинглюкурониды благодаря ферментным системам мембран активно перемещаются через них (против градиента концентрации) в желчные ходы, выделяясь вместе с желчью в просвет кишечника. В нем под воздействием ферментов, продуцируемых кишечной микрофлорой, происходит разрыв глюкуронидной связи. Высвобожденный свободный билирубин восстанавливается с образованием в тонком кишечнике сначала мезобилирубина, а затем и мезобилиногена (уробилиногена). В норме определенная часть мезобилиногена, всасываясь в тонком кишечнике и в верхнем отделе толстого, через систему воротной вены попадает в печень, где практически полностью разрушается (путем окисления), превращаясь в дипиррольные соединения – пропент-диопент и мезобилилейкан.
Мезобилиноген (уробилиноген) при этом в общий ток кровообращения не поступает. Часть его вместе с продуктами разрушения вновь направляется в просвет кишечника в составе желчи (энтерогепотальный круговорот). Однако даже при самых незначительных изменениях в печени ее барьерная функция во многом “снимается” и мезобилиноген попадает сначала в общий ток кровообращения, а затем в мочу. Основная же масса его направляется из тонкого кишечника в толстый, где под влиянием анаэробной микрофлоры (кишечной палочки и других бактерий) подвергается дальнейшему восстановлению с образованием стеркобилиногена. Образовавшийся стеркобилиноген (суточное количество 100-200 мг) почти полностью выделяется с калом. На воздухе он окисляется и превращается в стеркобилин, являющийся одним из пигментов кала. Небольшая часть стеркобилиногена попадает путем всасывания через слизистую оболочку толстого кишечника в систему нижней полой вены, доставляется с кровью в почки и выделяется с мочой.
Таким образом, в моче здорового человека мезобилиноген (уробилиноген) отсутствует, но в ней содержится некоторое количество стеркобилина (который часто не совсем правильно называют “уробилином”)
Для определения содержания билирубина в сыворотке (плазме) крови используют в основном химические и физико-химические методы исследования, среди которых выделяют колориметрические, спектрофотометрические (ручные и автоматизированные), хроматографические, флюориметрические и некоторые другие.
Один из важных субъективных признаков нарушения пигментного обмена – появление желтухи, которое отмечается обычно при уровне билирубина в крови 27-34 мкмоль/л и более. Причинами гипербилирубинемии могут быть: 1) усиление гемолиза эритроцитов (более 80% общего билирубина представлено неконъюгированным пигментом); 2) нарушение функции печеночных клеток и 3) задержка оттока желчи (гипербилирубинемия имеет печеночное происхождение, если более 80% общего билирубина составляет конъюгированный билирубин). В первом случае говорят о так называемой гемолитической желтухе, во втором – о паренхиматозной (может быть вызвана наследственно обусловленными дефектами в процессах транспорта билирубина и его глюкуронидирования), в третьем – о механической (или обтурационной, застойной) желтухе.
При паренхиматозной форме желтухи отмечаются деструктивно-дистрофические изменения в паренхиматозных клетках печени и инфильтративные – в строме, приводящие к повышению давления в желчных протоках. Застою билирубина в печени способствует также резкое ослабление метаболических процессов в пораженных гепатоцитах, которые теряют способность нормально выполнять различные биохимические и физиологические процессы, в частности переводить связанный билирубин из клеток в желчь против градиента концентрации. Повышение концентрации связанного билирубина в крови приводит к его появлению в моче.
Наиболее “тонким” признаком поражения печени при гепатитах служит появление мезобилиногена (уробилиногена) в моче.
При паренхиматозной желтухе увеличивается главным образом концентрация связанного (коньюгированного) билирубина в крови. Содержание свободного билирубина возрастает, но в меньшей степени.
В основе патогенеза обтурационной желтухе лежит прекращение поступления желчи в кишечник, что приводит к исчезновению стеркобилиногена из мочи. При застойной желтухе увеличивается главным образом содержание связанного билирубина крови. Внепеченочные холестатические желтухи сопровождаются триадой клинических признаков: обесцвеченным калом, темной мочой и зудом кожи. Внутрипеченочныйхолестаз клинически проявляется зудом кожи и желтухой. При лабораторном исследовании отмечается гипербилирубинемия (за счет связанного), билирубинурия, повышение щелочной фосфатазы при нормальных значениях трансаминаз в сыворотке крови.
Гемолитические желтухи обусловлены гемолизом эритроцитов и, как следствие, повышенным образованием билирубина. Повышение содержания свободного билирубина является одним из главных признаков гемолитической желтухи.
В клинической практике выделяют врожденные и приобретенные функциональные гипербилирубинемии, обусловленные нарушением элиминации билирубина из организма (наличие дефектов в ферментных и других системах переноса билирубина через мембраны клеток и его глюкуронидирования в них). Синдром Жильбера - наследственное доброкачественное хроническое заболевание, протекающее с умеренно выраженной негемолитической неконъюгированной гипербилирубинемией. Постгепатитная гипербилирубинемия Калька - приобретенный энзимный дефект, приводящий к увеличению уровня свободного билирубина в крови, врожденная семейная негемолитическая желтуха Криглера – Найяра (отсутствие в гепатоцитахглюкуронилтрансферазы), желтуха при врожденном гипотириозе (тироксин стимулирует ферментную глюкуронилтрансферазную систему), физиологическая желтуха новорожденных, лекарственная желтуха и др.
Нарушения пигментного обмена могут быть вызваны изменениями не только в процессах распада гемма, но и в образовании его предшественников – порфиринов (циклические органические соединении, в основе которых лежит кольцо порфина, состоящее из 4 пирролов, соединенных метиновыми мостиками). Порфирии – группа наследственных заболеваний, сопровождающихся генетическим дефицитом активности энзимов, принимающих участие в биосинтезе гемма, при которых в организме обнаруживается увеличение содержания порфиринов или их предшественников, что обуславливает ряд клинических признаков (избыточное образование продуктов метаболизма, вызывает развитие неврологических симптомов и (или) повышение фоточувствительности кожи).
Наиболее широко используемые методы определения билирубина основаны на его взаимодействии с диазореагентом (реактивом Эрлиха). Широкое распространение получил метод Ендрассика- Грофа. В этом методе в качестве «освободителя» билирубина используют смесь кофеина и бензоата натрия в ацетатном буфере. Ферментативное определение билирубина основано наего окислении билирубиноксидазой. Возможно определение неконъюгированного билирубина и другими методами ферментативного окисления.
В настоящее время все большее распространение, особенно при экспресс-диагностике, получает определение билирубина методами «сухой химии».
Витамины.
Витаминами называют незаменимые низкомолекулярные вещества, поступающие в организм с пищей извне и участвующие в регуляции биохимических процессов на уровне ферментов.
Сходство и различие витаминов и гормонов.
Сходство – регулируют метаболизм в организме человека через ферменты:
· Витамины входят в состав ферментов и являются коферментами или кофакторами;
· Гормоны или регулируют активность уже имеющихся ферментов в клетке, или являются индукторами или репрессорами вв биосинтезе необходимых ферментов.
Различие:
· Витамины – низкомолекулярные органические соединения, экзогенные факторы регуляции метаболизма и поступают с пищей извне.
· Гормоны – высокомолекулярные органические соединения, эндогенные факторы, синтезирующиеся в эндокринных железах организма в ответ на изменение внешней или внутренней среды организма человека, и также регулируют метаболизм.
Витамины классифицируются на:
1. Жирорастворимые: A, D, E, K, А.
2. Водорастворимые: группа В, PP, H, C, ТГФК (тетрагидрофолиевая кислота), пантотеновая кислота (В 3), Р (рутин).
Витамин А (ретинол, антиксерофтальмический) – химическая структура представлена β- иононовым кольцом и 2 остатками изопрена; потребность в организме составляет 2,5-30 мг в сутки.
Наиболее ранний и специфический признак гиповитаминоза А - гемералопия (куриная слепота) - нарушение сумеречного зрения. Возникает из-за недостатка зрительного пигмента - родопсина. Родопсин содержит в качестве активной группы ретиналь (альдегид витамина А) - находится в палочках сетчатки. Эти клетки (палочки) воспринимают световые сигналы низкой интенсивности.
Родопсин = опсин (белок) + цис-ретиналь.
При возбуждении родопсина светом, цис-ретиналь, в результате ферментативных перестроек внутри молекулы переходит в полностью-транс-ретиналь (на свету). Это приводит к конформационной перестройке всей молекулы родопсина. Родопсин диссоциирует на опсин и транс-ретиналь, что является пусковым механизмом, возбуждающим в окончаниях зрительного нерва импульс, который затем передается в мозг.
В темноте, в результате ферментативных реакций транс-ретиналь вновь превращается в цис-ретиналь и, соединяясь с опсином, образует родопсин.
Витамин А также влияет на процессы роста и развития покровного эпителия. Поэтому при авитаминозе наблюдается поражение кожи, слизистых оболочек и глаз, которое проявляется в патологическом ороговении кожи и слизистых. У больных развивается ксерофтальмия - сухость роговой оболочки глаза, так как происходит закупорка слезного канала в результате ороговения эпителия. Так как глаз перестает омываться слезой, которая обладает бактерицидным действием, развиваются конъюнктивиты, изъязвление и размягчение роговицы - кератомаляция. При авитаминозе А может быть также поражение слизистой ЖКТ, дыхательных и мочеполовых путей. Нарушается устойчивость всех тканей к инфекциям. При развитии авитаминоза в детстве - задержка роста.
В настоящее время показано участие витамина А в защите мембран клеток от окислителей - т. е. витамин А обладает антиоксидантной функцией.
Различной плотности и являются показателями липидного обмена. Существую различные методы количественного определения общих липидов: колориметрические, нефелометрические.
Принцип метода. Продукты гидролиза ненасыщеных липидов образуют с фосфованилиновым реактивом соединение красного цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональны содержанию общих липидов.
Большинство липидов находится в крови не в свободном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов: хиломикронах, α-липопротеинах, β-липопротеинах. Липопротеины можно разделить различными методами: центрифугированием в солевых растворах различной плотности, электрофорезом, тонкослойной хроматографией. При ультрацентрифугировании выделяются хиломикроны и липопротеины разной плотности: высокой (ЛПВП - α-липопротеины), низкой (ЛПНП - β-липопротеины), очень низкой (ЛПОНП - пре-β-липопротеины) и др.
Фракции липопротеинов отличаются по количеству белка, относительной молекулярной массе липопротеинов и процентному содержанию отдельных липидных компонентов. Так, α-липопротеины, содержащие большое количество белка (50-60%), имеют более высокую относительную плотность (1,063-1,21), тогда как β-липопротеины и пре-β-липопротеины содержат меньше белка и значительное количество липидов - до 95% от всей относительной молекулярной массы и низкую относительную плотность (1,01-1,063).
Принцип метода . При взаимодействии ЛПНП сыворотки крови с гепариновым реактивом появляется мутность, интенсивность которой определяется фотометрически. Гепариновый реактив представляет собой смесь гепарина с хлоридом кальция.
Исследуемый материал : сыворотка крови.
Реактивы : 0,27%-ный раствор CaCl 2 , 1%-ный раствор гепарина.
Оборудование : микропипетка, ФЭК, кювета с длиной оптического пути 5 мм, пробирки.
ХОД РАБОТЫ . В пробирку вносят 2 мл 0,27%-ного раствора СаCl 2 и 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора (Е 1) против 0.27%-ного раствора СаCl 2 в кюветах при красном светофильтре (630 нм). Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,04 мл 1%-ного раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е 2) в тех же условиях.
Вычисляют разность оптической плотности и умножают ее на 1000 - коэффициент эмпирический, предложен Ледвиной, так как построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. Ответ выражают в г/л.
х(г/л) = (Е 2 - Е 1) · 1000.
. Содержание ЛПНП (b-липопротеинов) в крови колеблется в зависимости от возраста, пола и составляет в норме 3,0-4,5 г/л. Увеличение концентрации ЛПНП наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, диабете, гликогенозах, ксантоматозе и ожирении, снижение - при b-плазмоцитоме. Среднее содержание холестерина в ЛПНП около 47%.
Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)
Холестерин экзогенный в количестве 0,3-0,5 г поступает с пищевыми продуктами, а эндогенный синтезируется в организме в количестве 0,8-2 г в сутки. Особенно много синтезируется холестерина в печени, почках, надпочечниках, артериальной стенке. Холестерин синтезируется из 18 молекул ацетил-СоА, 14 молекул NADPH, 18 молекул АТР.
При добавлении к сыворотке крови уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты жидкость окрашивается последовательно в красный, синий и наконец зеленый цвет. Реакция обусловлена образованием сульфокислоты холестерилена зеленого цвета.
Реактивы : реактив Либермана-Бурхарда (смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты в соотношении 1:5:1), стандартный (1,8 г/л) раствор холестерина.
Оборудование : сухие пробирки, сухие пипетки, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, термостат.
ХОД РАБОТЫ . Все пробирки, пипетки, кюветы должны быть сухими. Работать с реактивом Либермана-Бурхарда нужно очень осторожно. В сухую пробирку помещают 2,1 мл реактива Либермана-Бурхарда, очень медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови, энергично встряхивают пробирку, а затем термостатируют 20 мин при 37ºС. Развивается изумрудно-зеленая окраска, которую колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре (630-690 нм) против реактива Либермана-Бурхарда. Полученную на ФЭКе оптическую плотность используют для определения концентрации холестерина по калибровочному графику. Найденную концентрацию холестерина умножают на 1000, так как сыворотки в опыт берется 0,1 мл. Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0258. Нормальное содержание общего холестерина (свободного и эстерифицированного) в сыворотке крови 2,97-8,79 ммоль/л (115-340 мг%).
Построение калибровочного графика . Из стандартного раствора холестерина, где в 1 мл содержится 1,8 мг холестерина, берут по 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 мл и доводят до объема 2,2 мл реактивом Либермана-Бурхарда (соответственно 2,15; 2,1; 2,05; 2,0; 1,95 мл). Количество холестерина при этом в пробе составляет 0,09; 0,18; 0,27; 0,36; 0,45 мг. Полученные стандартные растворы холестерина, так же как и опытные пробирки, энергично встряхивают и помещают в термостат на 20 мин, после чего фотометрируют. Калибровочный график строят по величинам экстинкций, полученных в результате фотометрирования стандартных растворов.
Клинико-диагностическое значение . При нарушении жирового обмена холестерин может накапливаться в крови. Увеличение содержания холестерина в крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе , сахарном диабете , механической желтухе, нефрите , нефрозе (особенно липоидных нефрозах), гипотиреозе. Понижение холестерина в крови (гипохолестеринемия) наблюдается при анемиях, голодании, туберкулезе , гипертиреозе , раковой кахексии, паренхиматозной желтухе, поражении ЦНС, лихорадочных состояниях, при введении
Исследования обмена липидов и липопротеинов (ЛП), холестерина (ХС), в отличие от других диагностических тестов, имеют социальное значение, так как требуют неотложных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Проблема коронарного атеросклероза показала четкую клиническую значимость каждого биохимического показателя как фактора риска ишемической болезни сердца (ИБС), и в последнее десятилетие изменились подходы к оценке нарушений липидного и липопротеинового обмена.Риск развития атеросклеротического поражения сосудов оценивают по следующим биохимическим тестам:
Определение отношений ОХС/ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП.
Триглицериды
ТГ - нейтральные нерастворимые липиды, поступающие в плазму из кишечника или из печени.
В тонком кишечнике ТГ синтезируются из экзогенных, поступивших с пищей жирных кислот, глицерола и моноацилглицеролов.
Образованные ТГ первоначально поступают в лимфатические сосуды, затем в виде хиломикронов (ХМ) через грудной лимфатический проток поступают в кровоток. Время жизни ХМ в плазме невелико, они поступают к жировым депо организма.
Наличием ХМ объясняется белесый цвет плазмы после приема жирной пищи. ХМ быстро освобождаются от ТГ при участии липопротеинлипазы (ЛПЛ), оставляя их в жировых тканях. В норме после 12-часового голодания ХМ не определяются в плазме. В связи с низким содержанием белка и высоким количеством ТГ ХМ при всех видах электрофореза остаются на линии старта.
Наряду с поступающими с пищей ТГ в печени из эндогенно синтезированных жирных кислот и трифосфоглицерола, источником которого является обмен углеводов, образуются эндогенные ТГ. Эти ТГ транспортируются кровью к жировым депо организма в составе липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). ЛПОНП являются главной транспортной формой эндогенных ТГ. Содержание ЛПОНП в крови коррелирует с подъемом уровня ТГ. При высоком содержании ЛПОНП плазма крови выглядит мутной.
Для исследования ТГ используется сыворотка крови или плазма крови после 12-часового голодания. Хранение образцов возможно в течение 5-7 дней при температуре 4 °С, не допускается повторное замораживание и оттаивание проб.
Холестерин
ХС является составной частью всех клеток организма. Он входит в состав клеточных мембран, ЛП, является предшественником стероидных гормонов (минерало- и глюкокортикоидов, андрогенов и эстрогенов).
ХС синтезируется во всех клетках организма, однако основная его масса образуется в печени и поступает с пищей. В сутки организм синтезирует до 1 г ХС.
ХС - гидрофобное соединение, основной формой транспорта которого в крови являются белок-липидные мицеллярные комплексы ЛП. Их поверхностный слой образуют гидрофильные головки фосфолипидов, аполипопротеинов, ХС эстерифицированный более гидрофилен, чем ХС, поэтому эфиры ХС с поверхности перемещаются в центр липопротеиновой мицеллы.
Основная часть ХС транспортируется кровью в виде ЛПНП от печени к периферическим тканям. Аполипопротеином ЛПНП является апо-В. ЛПНП взаимодействуют с апо-В-рецепторами плазматических мембран клеток, захватываются ими путем эндоцитоза. Освобождающийся в клетках ХС используется для построения мембран и эстерифицируется. ХС с поверхности клеточных мембран вступает в мицеллярный комплекс, состоящий из фосфолипидов, апо-А, и образует ЛПВП. ХС в составе ЛПВП подвергается эстерификации под действием лецитинхолестеролацил-трансферазы (ЛХАТ) и поступает в печень. В печени поступивший в составе ЛПВП ХС подвергается микросомальному гидроксилированию, превращается в желчные кислоты. Выделение его происходит как в составе желчи, так и в виде свободного ХС или его эфиров.
Исследование уровня ХС не дает диагностической информации об определенном заболевании, а характеризует патологию обмена липидов и ЛП. Наиболее высокие цифры ХС имеют место при генетических нарушениях обмена ЛП: семейная гомо- и гетерозиготная гиперхолестеринемия, семейная комбинированная гиперлипидемия, полигенная гиперхолестеринемия. При ряде заболеваний развивается вторичная гиперхолестеринемия: нефротический синдром, сахарный диабет, гипотиреоз, алкоголизм.
Для оценки состояния липидного и ЛП обмена определяют величины ОХС, ТГ, ХС ЛПВП, ХС ЛПОНП, ХС ЛПНП.
Определение этих величин позволяет рассчитать коэффициент атерогенности (Ка):
Ка = ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПОНП,
И другие показатели. Для расчетов необходимо также знание следующих пропорций:
ХС ЛПОНП = ТГ (ммоль/л) /2,18; ХС ЛПНП = ОХС – (ХС ЛПВП + ХС ЛПОНП).
Определение показателей липидного профиля крови необходимо для диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Важнейшим механизмом развития подобной патологии считается образование на внутренней стенке сосудов атеросклеротических бляшек. Бляшки представляют собой скопление жиросодержащих соединений (холестерина и триглицеридов) и фибрина. Чем больше концентрация липидов в крови, тем вероятное появление атеросклероза. Поэтому и необходимо систематически сдавать анализ крови на липиды (липидограмму), это поможет своевременно выявить отклонения жирового обмена от нормы.
Липидограмма – исследование, определяющее уровень липидов различных фракций
Атеросклероз опасен высокой вероятностью развития осложнений - инсульт, инфаркт миокарда, гангрена нижних конечностей. Эти заболевания зачастую заканчиваются инвалидизацией больного, а в некоторых случаях и летальным исходом.
Роль липидов
Функции липидов:
- Структурная. Гликолипиды, фосфолипиды, холестерин являются важнейшими составляющими клеточных мембран.
- Теплоизоляционная и защитная. Излишки жиров откладываются в подкожно-жировой клетчатке, уменьшая потери тепла и защищая внутренние органы. При необходимости запас липидов используется организмом для получения энергии и простых соединений.
- Регуляторная. Холестерин необходим для синтеза стероидных гормонов надпочечников, половых гормонов, витамина Д, желчных кислот, входит в состав миелиновых оболочек головного мозга, нужен для нормального функционирования серотониновых рецепторов.
Липидограмма
Липидограмма может назначаться врачом как при подозрении на имеющуюся патологию, так и в профилактических целях, например, при проведении диспансеризации. Она включает в себя несколько показателей, позволяющих в полной мере оценить состояние обмена жиров в организме.
Показатели липидограммы:
- Общий холестерин (ОХ). Это важнейший показатель липидного спектра крови, включает в себя свободный холестерин, а также холестерин, содержащийся в липопротеидах и находящийся в связи с жирными кислотами. Значительная часть холестерина синтезируется печенью, кишечником, половыми железами, лишь 1/5 часть ОХ поступает с пищей. При нормально функционирующих механизмах липидного обмена небольшой недостаток или избыток холестерина, поступающего с пищей, компенсируется усилением или же ослаблением его синтеза в организме. Поэтому гиперхолестеринемия чаще всего обусловлена не избыточным поступлением холестерина с продуктами, а сбоем процесса жирового обмена.
- Липопротеиды высокой плотности (ЛПВП). Этот показатель имеет обратную взаимосвязь с вероятностью развития атеросклероза - повышенный уровень ЛПВП считается антиатерогенным фактором. ЛПВП транспортируют холестерин в печень, где он утилизируется. У женщин уровень ЛПВП выше, чем у мужчин.
- Липопротеиды низкой плотности (ЛПНП). ЛПНП переносят холестерин из печени в ткани, иначе его называют «плохим» холестерином. Связано это с тем, что ЛПНП способны образовывать атеросклеротические бляшки, сужающие просвет сосудов.
Так выглядит ЛПНП-частица
- Липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП). Основной функцией этой разнородной по размерам и составу группы частиц является транспорт триглицеридов из печени в ткани. Высокая концентрация ЛПОНП в крови приводит к помутнению сыворотки (хилез), также повышается возможность появления атеросклеротических бляшек, особенно у пациентов с сахарным диабетом и патологиями почек.
- Триглицериды (ТГ). Как и холестерин, триглицериды переносятся по кровеносному руслу в составе липопротеидов. Поэтому повышение концентрации ТГ в крови всегда сопровождается ростом уровня холестерина. Триглицериды считаются главным источником энергии для клеток.
- Коэффициент атерогенности. Он позволяет оценить риск развития патологии сосудов и является своеобразным итогом липидограммы. Для определения показателя необходимо знать значение ОХ и ЛПВП.
Коэффициент атерогенности = (ОХ — ЛПВП)/ЛПВП
Оптимальные значения липидного профиля крови
Пол | Показатель, ммоль/л | |||||
ОХ | ЛПВП | ЛПНП | ЛПОНП | ТГ | КА | |
Мужской | 3,21 — 6,32 | 0,78 — 1,63 | 1,71 — 4,27 | 0,26 — 1,4 | 0,5 — 2,81 | 2,2 — 3,5 |
Женский | 3,16 — 5,75 | 0,85 — 2,15 | 1,48 — 4,25 | 0,41 — 1,63 |
Следует учитывать то, что значение измеряемых показателей может меняться в зависимости от единиц измерения, методики проведения анализа. Нормальные значения также варьируют в зависимости от возраста пациента, вышеприведенные показатели являются усредненными для лиц 20 — 30 лет. Норма холестерина и ЛПНП у мужчин после 30 лет имеет тенденцию к увеличению. У женщин показатели резко возрастают при наступлении менопаузы, это связано с прекращением антиатерогенной деятельности яичников. Расшифровку липидограммы должен обязательно проводить специалист с учетом индивидуальных особенностей человека.
Исследование уровня липидов в крови может назначаться врачом для диагностики дислипидемий, оценки вероятности развития атеросклероза, при некоторых хронических заболеваниях (сахарный диабет, болезни почек и печени, щитовидной железы), а также в качестве скринингового исследования для раннего выявления лиц с отклонениями липидного профиля от нормы.
Врач дает пациентке направление на липидограмму
Подготовка к исследованию
Значения липидограммы могут колебаться не только в зависимости от пола и возраста испытуемого, но и от воздействия на организм разнообразных внешних и внутренних факторов. Чтобы минимизировать вероятность недостоверного результата, необходимо придерживаться нескольких правил:
- Сдавать кровь следует строго утром натощак, вечером предыдущего дня рекомендуется легкий диетический ужин.
- Не курить и не употреблять спиртное накануне исследования.
- За 2-3 дня до сдачи крови избегать стрессовых ситуаций и интенсивных физических нагрузок.
- Отказаться от употребления всех лекарственных препаратов и биодобавок, кроме жизненно необходимых.
Методика проведения
Существует несколько методов лабораторной оценки липидного профиля. В медицинских лабораториях анализ может проводиться вручную или же с использованием автоматических анализаторов. Преимуществом автоматизированной системы измерения является минимальный риск ошибочных результатов, быстрота получение анализа, высокая точность исследования.
Для анализа необходима сыворотка венозной крови пациента. Кровь забирается в вакуумную пробирку при помощи шприца или вакутейнера. Во избежание формирования сгустка пробирку с кровью следует несколько раз перевернуть, затем отцентрифугировать для получения сыворотки. Пробу можно хранить в холодильнике в течение 5 суток.
Взятие крови на липидный профиль
В настоящее время липиды крови можно измерить, не выходя из дома. Для этого необходимо приобрести портативный биохимический анализатор, позволяющий оценить уровень общего холестерина в крови или сразу несколько показателей за считанные минуты. Для исследования нужна капелька капиллярной крови, ее наносят на тест-полоску. Тест-полоска пропитана специальным составом, для каждого показателя он свой. Считывание результатов происходит автоматически после установки полоски в прибор. Благодаря небольшим размерам анализатора, возможности работы от батареек его удобно использовать в домашних условиях и брать с собой в поездку. Поэтому лицам с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям рекомендуется иметь его дома.
Интерпретация результатов
Самым идеальным для пациента результатом анализа будет лабораторное заключение об отсутствии отклонений показателей от нормы. В таком случае человеку можно не опасаться за состояние своей кровеносной системы - риск атеросклероза практически отсутствует.
К сожалению, так бывает далеко не всегда. Иногда врач после ознакомления с лабораторными данными, выносит заключение о наличии гиперхолестеринемии. Что это такое? Гиперхолестеринемия - повышение концентрации общего холестерина в крови выше значений нормы, при этом отмечается высокий риск развития атеросклероза и сопутствующих ему заболеваний. Обусловлено такое состояние может быть рядом причин:
- Наследственность. Науке известны случаи семейной гиперхолестеринемии (СГХС), в такой ситуации дефектный ген, отвечающий за метаболизм липидов передается по наследству. У больных наблюдается постоянно повышенный уровень ОХ и ЛПНП, особенно тяжело болезнь протекает у гомозиготной формы СГХС. У таких пациентов отмечается раннее появление ИБС (в возрасте 5-10 лет), при отсутствии должного лечения прогноз неблагоприятный и в большинстве случаев заканчивается летальным исходом до достижения 30 лет.
- Хронические заболевания. Повышенный уровень холестерина отмечается при сахарном диабете, гипотиреозе, патологии почек и печени, обусловлен нарушениями липидного обмена вследствие данных болезней.
Для пациентов, страдающих сахарным диабетом, важно постоянно контролировать уровень холестерина
- Неправильное питание. Длительное злоупотребление фастфудом, жирной, соленой пищей приводит к ожирению, при этом, как правило, наблюдается отклонение уровня липидов от нормы.
- Вредные привычки. Алкоголизм и курение приводят к сбоям в механизме жирового обмена, вследствие чего увеличиваются показатели липидограммы.
При гиперхолестеринемии необходимо придерживаться диеты с ограничением жира и соли, но ни в коем случае нельзя полностью отказываться от всех продуктов, богатых холестерином. Исключить из рациона питания следует лишь майонез, фастфуд и все продукты, содержащие в своем составе трансжиры. А вот яйца, сыр, мясо, сметана обязательно должны присутствовать на столе, просто необходимо выбирать продукты с меньшим процентом жирности. Также в рационе важно наличие зелени, овощей, круп, орехов, морепродуктов. Содержащиеся в них витамины и минералы отлично помогают стабилизировать показатели липидного обмена.
Важным условием нормализации холестерина также является отказ от вредных привычек. Полезны для организма и постоянные физические нагрузки.
В том случае, если здоровый образ жизни в сочетании с диетой не привел к снижению холестерина, необходимо назначение соответствующего медикаментозного лечения.
Медикаментозное лечение гиперхолестеринемии включает в себя назначение статинов
Иногда специалисты сталкиваются со снижением уровня холестерина - гипохолестеринемией. Чаще всего такое состояние обусловлено недостаточным поступлением холестерина с пищей. Особенно опасен дефицит жиров для детей, в такой ситуации будет отмечаться отставание в физическом и психическом развитии, растущему организму холестерин жизненно необходим. У взрослых людей гипохолестериемия приводит к нарушению эмоционального состояния из-за сбоев в работе нервной системы, проблемам с репродуктивной функцией, снижению иммунитета и пр.
Изменение липидного профиля крови неизбежно сказывается на работе всего организма в целом, поэтому важно систематически контролировать показатели жирового обмена для своевременного лечения и профилактики.